SHELL – LESS CULTURE

 

      Oleh :

                                           Novi Sri Wahyuni                      B1J009074

                                           Lifannur G. Tyas                       B1J009197

                                           Ganesha R. R                            B1J010149

                                 TUGAS TERSTRUKTUR KULTUR JARINGAN HEWAN

  KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PURWOKERTO

2012

PENDAHULUAN

            Kultur jaringan (tissue culture) pertama kali digunakan pada abad 20. Metode ini mempelajari perilaku sel hewan yang bebas dari pengaruh variasi sistemik yang dapat timbul saat hewan dalam keadaan homeostasis ataupun dalam pengaruh percobaan (experiment). Saat ini kultur jaringan telah mengalami perkembangan yang berfungsi mempelajari aspek mekanisme kontrol dan diferensiasi fungsi sel. Berikut kultur jaringan yang sudah berkembang pesat: kultur sel-sel khusus, chromosome painting, dan DNA fingerprinting, tetapi teknologi dasar yang awal dikembangkan, berupa teknik kultur primer, pasase serial, karakterisasi, preservasi sel, dan yang lainnya, prinsipnya masih lama (Achmad, 2007).

            Istilah umum kultur jaringan meliputi kultur organ ataupun kultur sel. Kultur organ lebih banyak digunakan untuk kultur jaringan tiga dimensi yang tidak terurai dengan sebagian atau seluruh gambaran histologinya yang secara in vivo masih utuh. Sedangkan, istilah kultur sel digunakan untuk berbagai kultur yang berasal dari sel-sel yang terdispersi yang diambil dari jaringan asalnya dari kultur primer atau dari cell line atau cell strain secara enzimatik, mekanik, atau disagregasi kimiawi. Kultur histotypic digunakan untuk kultur jaringan yang menggabungkan kembali sel-sel yang telah terdispersi sedemikian rupa untuk membentuk kultur jaringan menyerupai struktur tiga dimensi. Contohnya pada pertumbuhan yang berlebih pada kultur monolayer, reagregasi pada suspensi sel, atau infiltrasi matriks tiga dimensi seperti pada penggunaan gel kolagen. Istilah kultur organotypic digunakan pada kultur dengan prosedur seperti kultur histotypic tetapi penggunaannya mengkombinasikan sel dari berbagai jenis yang berbeda, contohnya adalah keratosit epidermal yang dikombinasikan dengan mereagregasikan fibroblas dermal (Achmad, 2007).

Saat ini penggunaan teknik kultur sel sudah demikian luasnya dalam dunia biologis maupun medis. Secara fundamental, tujuan para peneliti dan pekerja dalam bidang kultur sel adalah mempersiapkan sel untuk dikultur lebih lanjut dan juga untuk memeliharanya dalam sistem yang bebas kontaminasi walaupun dilakukan subkultur berulang-ulang sesuai keperluan. Makin berkembangnya bidang bioteknologi menyebabkan kegiatan kultur sel menjadi ikut meluas. Berbagai metode baru telah dikembangkan sejalan dengan kebutuhan yang makin kompleks. Beberapa bidang ilmu yang menggunakan kultur sel antara lain biologi seluler, imunologi, farmakologi, biokimia, virologi, genetika, dan produksi berbagai bahan biologis.

            Metode kultur yang tengah banyak digunakan  untuk mengkaji perkembangan pada tahap embrio adalah shell-less culture. Metode ini dapat diandalkan untuk menguji kadar gula dari tahap perkembangan embrio. Kadar glukosa yang berlebihan dapat berpengaruh negatif terhadap pertumbuhan janin, termasuk pengembangan sistem saraf pusat, keterbelakangan pertumbuhan. Kemudian pembangunan dan komplikasi bawaan malforasi telah banyak diinformasikan pada bayi dari ibu yang mengalami diabetes dari kondisi kehamilan normal. Metode shell-less culture juga dapat dipergunakan untuk memastikan efek dari pengobatan glukosa pada embrio ayam yang berkembang setiap tahap, untuk mengidentifikasi gangguan pertumbuhan, dan berbagai malformasi tergantung pada konsentrasi glukosa dan tahap pembangunan (Datar, 2005). Selain untuk menguji kadar glukosa, shell-less culture juga dapat dipergunakan untuk menguji dampak negatif pengaruh nikotin terhadap janin yang dapat merusak sistem saraf pusat dan pengurangan kadar DNA di otak (Hamamichi dan Nishigori, 2001). Keuntungan menggunakan teknik shell-less culture adalah biayanya relatif murah, sederhana, dan efektif (Tufan et al., 2004).

Manfaat  model kultur ini diantaranya adalah sebagai media untuk mengamati langsung perkembangan embrio vertebrata dan keragaman percobaan manipulasi selama perkembangannya. Juga dapat berguna sebagai sarana untuk deteksi dini faktor-faktor yang membahayakan perkembangan (Hamamichi dan Nishigori, 2001). Selain itu menurut Taufan et al., (2005) metode ini dapat dilakukan dengan mudah, efisien, murah, sederhana, namun dibutuhakan sedikit latihan dalam melakukan teknik ini agar didapatkan hasil yang optimal.

PEMBAHASAN

Secara umum kultur Shell-less embrio dapat dilakukan pada berbagai macam jenis telur bercangkang dan pada penggunaan telur ayam sering disebut dengan chicks-in-plastic, chick-in-a-cup. Teknik ini  digunakan untuk mengamati perkembangan embrio diluar cangkang dari hari ke 3 hingga hari ke 18 selama masa inkubasi (Fisher, 1993). Metode kultur dilakukan secara utuh serta terdapat hubungan antara embrio dan kantung yolk sehingga dapat diamati perkembanganya  secara langsung (Duun, 1974 dan Hammaichi dan Nishigori, 2001). Preparasi kultur shell-less chick embryo dilakukan pada kondisi yang steril. Albumen tipis dari telur steril dimasukkan ke dalam cawan petri. Albumen ini berperan sebagai penahan benturan, menyediakan bantalan untuk kultur. Bagian paling penting pada saat memindahkan telur dari cangkang dilakukan tanpa merusak embrio dan kuning telur, serta posisi embrio ditempatkan pada sisi paling atas dari kuning telur yang bertujuan untuk mendukung tingkat kelangsungan hidup embrio berikutnya (Hammamici dan Nishigori, 2001). Adapun bahan dan alat yang dingunakan berupa etanol 70%, betadine solution, saline 0,85%, 30 mg kuning telur bubuk, 140 mg kalsium laktat, 2 ml albumin tipis, telur ayam fertile, cawan petri, streroform hot cup,  plastik wrapping, karet gelang (Dunn et al., 1981).  

Prosedur pelaksanaannya meliputi beberapa tahapan berikut:

1.      Tahap preparasi wadah biakan (Preparation of culture containers). Komposisi wadah kultur yang akan digunakan terdiri dari polyethylene film yang bersifat transparan dan semipermeabel dan dilengkapi dengan pengaman yang berupa karet pengikat pada bagian mulut cup plastik silinder (diameter = 7 cm; tinggi = 7 cm) ditutup dengan cawan petri yang tertutup plastik . Komposisi wadah kultur selanjutnya dipasteurisasi dengan sinar UV selama 1 jam.

2.      Penyiapan shell-less cultures. Isi telur dipindahkan secara aseptis kedalam tempat yang telah disiapkan. Telur fertil yang akan digunakan disemprot 70% etanol dan dikeringkan untuk mengurangi kontaminasi dari permukaan telur. Telur diletakkan secara horisontal dan biarkan selama 5 menit untuk memastikan posisi telur dalam keadaan stabil (Aurbach et al., 1974). Telur dibuka dengan memecah cangkang pada bagian bawah dan berikan 2 ml albumin ketika embrio telah berada pada bagian atas. Pemindahan  dilakukan tanpa merusak embrio dan yolk kemudian ditambahkan secara steril dengan 30 mg bubuk cangkang telur dan 140 mg calcium laktat yang dicampurkan dalam 2 mL albumin dengan konsentrasi 70 mg/mL (Kamihira et al., 1998). Sesuai petunjuk, dilakukan tahap preinkubasi telur ayam yang telah dibuahi selama 30-33 jam pada 37,5°C pada inkubator telur sampai mencapai 9 tahap sesuai yang dijelaskan oleh Hamburger dan Hamilton (1951). Dilanjutkan dengan menempatkan telur pada ruangan yang sejuk untuk menghindari terjadinya pemecahan kuning telur pada proses eksplantasi (Giles dan Bandigan, 1999).

3.      Isi telur dipindahkan dalam keadaan aseptik (di dalam lapisan berlapis) ke dalam wadah kultur  melalui pemecahan sisi bawah tepi. Hanya kultur dengan posisi blastodisc pada bagian sisi atas kuning telur yang digunakan. Setiap shell-less culture ditutup dengan cawan yang ditutup plastik steril, kemudian dipindahkan dalam inkubator pada 37,5°C dengan kelembaban yang jenuh kemudian ditetaskan sesuai dengan waktu yang dibutuhkan .

Metode kultur telah banyak dikemabangkan pada beberapa bidang serta digunakan untuk berbagai macam kepentingan, diantara dalam bidang kesehatan dan perkembangan.

1. Shell-Less Chick Embryo Culture sebagai Model Alternatif In Vitro untuk Mengetahui Glukosa Penyebab Cacat pada Embrio Mamalia

Pengembangan sistem pembiakan shell-less chick embryo secara sederhana untuk mengetahui glukosa penyebab cacat. Sistem ini meliputi pembiakan embrio ayam dari hari ke-2 sampai ke-5 masa inkubasi, yang dihubungkan dengan kuning telur dan ketebalan albumen yang menyelimuti telur. Embrio ayam dibiakkan pada cawan petri. Perkembangan embrio pada 24, 48 dan 72 jam pengeraman dengan perlakuan 2 konsentrasi glukosa 50 mM dan 100 mM untuk 24 jam. Perlakuan glukosa menghasilkan tingkat mortalitas lebih dari 70% pada embrio muda. Berbagai cacat seperti pertumbuhan yang terlambat, perkembangan jantung yang abnormal, makrosomia, exencephly dan lain-lain yang diteliti pada embrio tua sama seperti yang dilaporkan pada embrio mamalia yang merupakan akibat kehamilan diabetik. Glukosa penyebab cacat yang ditemukan tergantung pada konsentrasi dan tingkatnya, ditekankan pada peran derajat hiperglisemia dan tingkat perkembangan embrio pada anomali pertumbuhan diabetik. Penelitian ini menjelaskan bahwa sistem tersebut dapat digunakan untuk percobaan pada perkembangan embrio ayam pada tahap awal dan memperkirakan pengaruh toksisitas glukosa akut seperti yang dilaporkan pada embrio mamalia pada kondisi hiperglisemik (Datar dan Bhonde, 2005).

2. Shell-less culture of the chick embryo sebagai sistem model untuk mempelajari perkembangan neurologi.

Pengembangan lain dari shell-less culture embryo adalah dalam perkembangan neurologi yang bertujuan untuk menunjukkan shell-less culture system pada embrio ayam sebagai model penelitian lapangan yang potensial untuk mengamati perkembangan neurobiologi  sehingga dapat diketahui perkembangan sistem saraf pusat mulai dari awal, tahap three-vesicle brain stage up sampai tahap five-vesicle brain stage ketika embrio mempunyai daya tahan 100% untuk hidup. Kultur embrio ayam tanpa cangkang dianggap sebagai pemodelan yang sangat baik untuk mengetahui mekanisme yang mendasari pembentukan dan perkembangan system saraf pusat dari vertebrata (Tufan et al., 2004). Prosedur yang dilakukan meliputi persiapan embrio ayam dengan memilih telur fertil, persiapan wadah kultur dengan menggunakan perlatan yang telah ditentukan, dan  persiapan kultur shell-less. 

3. Shell-less culture digunakan untuk mengetahui pengaruh nikotin dari asap rokok terhadap perkembangan embrio.

Penggunaan metode kultur tanpa cangkang ini digunakan sebagai alternatif dalam penggunaan embrio mamalia yang dianggap lebih mahal. Penerapan kultur shell-less ini dilkukan untuk mengobservasi  efek farmakologis dari nikotin yang dilakukan selama 2 minggu pertama masa inkubasi. Penggunaannya dievalusi dengan menggunakan mini kamera agar lebih praktis dan mengurangi faktor berbahaya yang dapat mempengaruhi perkembangannya (Hammamici dan Nishigori, 2001). Penggunaan alat dan bahan disesuaikan dengan tujuan yang ingin dicapai, sedangkan pada bahasan ini bahan yang digunakan seperti cawan petri untuk angiogenesis (Auerbach et al., 1976). Plastik tripot untuk kultur dengan bungkus plastik sebagai metabolisme kalsium (Dunn dan Boone, 1977) dan tempat untuk meletekkan kuning telur (Perry, 1988). Dalam hal ini faktor yang berpengaruh adalah nikotin pada asap rokok. Nikotin dilaporkan memiliki dampak negatif pada pertumbuhan janin, termasuk pengembangan sistem saraf pusat dan pengurangan DNA konten dalam otak ( Ferriero dan Dempsey, 1999 ). Dalam percobaan, ayam yang terpapar nikotin telah dilaporkan mengalami perubahan biochebiokemikal embrionik pada otak ( pennington et al. , 1994 ). Sedangkan pemaparan asap rokok yang tinggi pada umur  sebelum kelahiran  dapat mengakibatkan  aborsi spontan, pemotongan placenta sebelum matang dan berbagai jenis kelainan bentuk ( Haustein, 1999 ).

Prosedur yang harus dilakukan yaitu, preparasi kultur shell-less embryo, persiapan larutan nikotin, persiapan ekstrak cair asap rokok, pemberian nikotin dan ekstra cairan asap rokok pada embrio ayam, analisis statistik pergerakan embrio, analisis kualitatif nikotin pada ekstrak cair asap rokok. Hasil yang didapat bahwa pemberian nikotin 0,1 mg hingga 10 mg terjadi perubahan dalam gerak embrio karena farmakologis dari nikotin dan hasil metabolit dari nikotin. Pemberian ekstrak cair asap rokok juga menyebabkan penurunan gerakan pada embrio. Pergerakan embrio selama 7 hari sangat bervariasi dari 2 hingga 9 kali per menit dalam selang 3 menit selama 60 menit. Setelah penambahan kadar nikotin, pada menit ke 15 yang paling menunjukan penurunan gerakan. Sedangkan pada kontrol  terlihat pada menit ke 18, pada embrio dengan penambahan 0,1 mg nikotin menunjukan adanya gerakan selama 20 menit setelah penambahan, sedangkan emberio yang ditambahkan 10 mg nikotin pemperlihatkan pemberhentian gerakan selama 15 menit setelah penambahan dan mulai kembali normal pada menit ke 33 dan menit ke 54. Pemberian ekstrak cair asap rokok menyebabkan penghentian gerakan embrioa selama 12 mneit setelah pemberian dan kembali normal pada menit ke 30 dan adanya tanda-tanda kembali pada kondisi semula pada menit ke 39 (Hammamici dan Nishigori, 2001).

                                                                                                    

KESIMPULAN

1. Shell-less culture system dapat dikembangkan pada bidang kesehtan bioteknologi dan perkembangan.
2. Shell-less culture system dapat digunakan sebagai evaluasi terhadap pengaruh pemberian glukosa pada enbrio, pengaruh nikotin serta dapat dikembangkan dalam neurologi.
3. Teknik dapat ini dilakukan dengan mudah, efisien, murah, sederhana, namun dibutuhakan sedikit latihan dalam melakukan teknik ini agar didapatkan hasil yang optimal.

DAFTAR REFERENSI

Achmad, H. T. Satu Abad Kultur Sel dan Jaringan: Perkembangan Teknologi dan Implementasinya. Fakultas Kedokteran Universitas Padjadjaran.

Auerbach R, Kubai L, Knighton D, Folkman J. A Simple Procedure for The Long- Term Cultivation of Chick Embryos. Dev Biol. Vol 41(2) : 391-394.

Datar, S., Bhonde, R. R. 2005. Shell-less chick embryo culture as an alternative in vitro model to investigate glucose-induced malformations in mammalian embryos. The review of Diabetic Studies. Vol 2 (4) : 221-227.

Dunn BE. Technique of Shell-less Culture of The 72-Hour Avian Embryo. Poult. Sci. 53: 409–412.

Dunn, B.E., Boone, M.A., 1977. Growth and Mineral Content of Cultured Chick Embryos. Poultry Sci. 56 : 662–672.

Dunn, B.E., Fitzharris, T.P., Barnett, B.D., 1981. Effects of Varying Chamber Construction and Embryo Pre-incubation Age on Survival and Growth of Chick Embryos in Shell-less Culture. Anat. Rec. 199 : 33–43.

Ferriero, D.M., Dempsey, D.A., 1999. Impact of Addictive and Harmful Substances on Fetal Brain Development. Curr. Opin. Neurol. 12 : 161–166.

Hamamichi, S., Nishigori, H. 2001. Establishment of a chick embryo shell-less culture system and its use to observe change in behavior caused by nicotine and substances from cigarette smoke. Journal Toxicology Letter.  119 : 95-102.

Hamburger V, Hamilton HL. A Series of Normal Stages in The Development of Chick Embryos. J Morphol. 88 : 49-92.

Haustein, K.O., 1999. Cigarette Smoking, Nicotine and Pregnancy. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 37 : 417–427.

Kamihira, M., Oguchi, S., Tachibana, A., Kitagawa, Y., Iijima, S., 1998. Improved Hatching for in Vitro Quail Embryo Culture Using Surrogate Eggshell and Artificial Vessel. Dev. Growth Differ. 40 : 449–455.

Perry, M.M., 1988. A Complete Culture System for The Chick Embryo. Nature. 331 : 70–72.

Tufan, C. A., Akdogan, I., and Adiguzel, E. 2004. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. Vol 3 : 8-11.